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02.05.02 --
Siggi Kuipers
Borreliose beim Hund/Diagnostik,Verfahren etc........
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Borreliose-Diagnostik beim Hund - Möglichkeiten und Grenzen verschiedener Labor-Methoden
Peter Kopp
Institut für klinische Prüfung Ludwigsburg GmbH
Veterinärmedizinisches Labor, 1998
Wie jedes Jahr im Frühsommer ist jetzt die erste Zeckenwelle in vollem Gange. Und wie immer um diese Jahreszeit bringen die Hunde eine Vielzahl an Zecken von ihren Spaziergängen mit nach Hause. Seit das Wissen auch in der breiten Bevölkerung über die gesundheitliche Gefährdung durch Zeckenstiche beim Menschen, vor allem durch die FSME oder die Borreliose, wächst, steigt auch die Angst über eine mögliche Gefährdung der Hunde durch die entsprechenden Erreger.
Dieser Artikel soll einen kurzen Überblick über labormedizinische Verfahren, deren richtigen Einsatzbereich sowie die Grenzen der einzelnen Verfahren aufzeigen.
Borrelia (B.) burgdorferi, der Erreger der Lyme-Borreliose, hat den Namen nach seinem Entdecker W. Burgdorfer, der zusammen mit dem Rheumatologen A. Steere Anfang der achtziger Jahre dieses Bakterium aus Zecken in der Umgebung der Gemeinde Lyme in Connecticut, USA isolieren konnte. Der Hintergrund dieser intensiven Forschung war ein gehäuftes Auftreten von Arthritiden vor allem bei Kindern in diesem Gebiet. Mit der Kenntnis dieser Fakten ist man auch schon bei zwei wesentlichen Problempunkten bezüglich der Borrelien-Diagnostik beim Hund:
Viele der "Erkenntnisse" der Borreliose beim Hund wurden direkt vom Wissen aus der Humanmedizin abgeleitet und
Viele dieser Kenntnisse stammen aus den USA.
Beides ist im Prinzip nicht falsch, bedarf aber einer kritischen Betrachtung.
zu 1.: In der Humanmedizin haben seit der Entdeckung von B. burgdorferi intensive Forschungen vor allem im Bereich der Epidemiologie und zur Aufklärung des klinischen Krankheitsbildes sowie deren frühzeitige Erkennung und Therapie stattgefunden. Man konnte nachvollziehen, daß die Borrelien durch den Zeckenstich übertragen werden und sich dann anschließend in verschiedenen Organsystemen (z.B. Haut, Gelenke, ZNS) manifestierten. Es wurde aus Erfahrungen mit dem Erreger der Syphillis, Treponema pallidum, der in die selbe Gruppe der Bakterien gehört wie B. burgdorferi, ein 3-stufiger Verlauf der Lyme Borreliose postuliert. Im ersten Stadium reagiert der Mensch mit Allgemeinsyptomen wie Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen, Fieber, Myalgien u.a. und häufig ist um die Bißstelle eine sog. Wanderröte, das Erythema migrans (EM), zu erkennen. Im zweiten Stadium werden neurologische, kardiale, arthrogene oder ophtalmologische Symptome beobachtet. Im letzten Stadium reagiert der Mensch u.a. mit einer chronischen Arthritis, einer chronischen Enzephalitis oder der sog. Acrodermatitis chronica athrophicans (ACA), einer Erkrankung, bei der die Haut sich pergamentartig verändert. Diese Aufzählung zeigt schon, wie komplex und vielseitig das Erscheinumgsbild der Lyme-Borreliose beim Menschen sein kann. Genauso vielseitig sind die Krankheitsbilder, die beim Hund im Zusammenhang mit der Borreliose beschrieben werden. Allerdings halten nur wenige dieser Berichte einer genaueren wissenschaftlichen Betrachtung stand. Aus der Humanmedizin bekannte Syptome einer Borreliose auf den Hund zu übertragen und bei positiver Serologie die Schlußfolgerung zu ziehen, daß ein direkter Zusammenhang besteht, bedarf einer genauen Abklärung sämtlicher anderer in Frage kommenden Ursachen.
zu 2.: Die zweite angesprochene Problematik besteht darin, daß man seit einigen Jahren weiß, daß von B. burgdorferi mehrere unterschiedliche Genospezies existieren. Man spricht daher heute von B. burgdorferi sensu lato, die sich u.a. in B. burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii sowie Borrelia afzelii aufteilt. Das Interessante daran ist, daß man in den USA hauptsächlich B. burgdorferi sensu stricto isolieren konnte. Im Gegensatz dazu werden in Europa alle 3 genannten Genospezies isoliert. Da in den USA das am häufigsten beobachtete Symptom der Lyme-Borreliose die Arthritis ist, geht man heute davon aus, daß B. burgdorferi sensu stricto einen Organtropismus für den Bewegungsapparat besitzt, Borrelia garinii eher disseminierte Formen der Borreliose verursacht bzw. die Neuroborreliose hervorruft und Borrelia afzelii eine Affinität zur Haut hat und Symptome wie das EM oder die ACA hervorruft. Selbstverständlich sind die unterschiedlichen Genospezies auch unterschiedlich in ihrer antigenen Struktur, was natürlich nicht nur Probleme in der serologischen Diagnostik sondern auch in der Entwicklung von Impfstoffen verursacht. Deshalb sind Entwicklungen von Testsystemen (v.a. von ELISA`s), oder gar Impfstoffen in den USA nicht ohne weiteres in Europa anzuwenden.
Was ist derzeit über die Borreliose beim Hund bekannt?. Erst 1992 gelang es Wasmoen et al. nachzuweisen, daß B. burgdorferi beim Hund die Kochschen Postulate erfüllt. Sie konnten Hunde experimentell infizieren (wobei die Hunde mit gestörtem Allgemeinbefinden, Gelenkssyptomen und Fieber reagierten), den Erreger anschließend aus den erkrankten Tieren isolieren und damit erneut eine Erkrankung bei anderen Hunden hervorrufen. Allerdings entsprach die Art der Infektion nicht dem natürlichen Infektionsweg (hochdosierte i.v.-Gabe von B. burgdorferi in Reinkultur über 7 Tage). Differenzierter waren die Infektionsversuche von Appel et al. (1993). Sie infizierten die Hunde über den Vektor Zecke, indem sie Hunden mit Borrelien infizierte Zecken anhefteten. Sie konnten dabei folgendes beobachten:
Das dominierende klinische Bild, das die Hunde zeigten, waren Lahmheiten. Diese Lahmheiten entwickelten sich zwischen 2-5 Monaten nach Infektion über die Zecken. Dabei zeigten die Tiere zuerst leichte Lahmheiten, die innerhalb von 3 Tagen zunahmen und nach 4 Tagen wieder verschwunden waren. Hauptsächlich waren davon die Ellenbogengelenke sowie die Karpal- und Kniegelenke betroffen. Palpatorisch konnte bei einigen Tieren eine leichte Schwellung sowie eine lokale Temperaturerhöhung festgestellt werden. Die meisten der an Lahmheiten erkrankten Hunde zeigten eine erhöhte Körpertemperatur (39,5-40°C) und waren apathisch. Gewichtsverluste konnten dabei nicht beobachtet werden. Nach der ersten Lahmheit entwickelten die meisten der Tiere eine zweite , teilweise eine dritte Lahmheit im Abstand von 2-4 Wochen. Dabei waren teilweise andere Gelenke als in der ersten Periode betroffen. Außer diesen Symptomen zeigten die Tiere innerhalb der Beobachtungsperiode von 17 Monaten keine anderen klinischen Anzeichen mehr. Ein EM konnte auch nach sorgfältigster Betrachtung der Einstichstelle nicht beobachtet werden. Die von anderen Autoren beschriebenen Erkrankungen wie z.B. Nierenfunktionsstörungen (Grauer et al., 1988) oder Herzblock (Levy und Duray, 1988) bestätigten sich auch in der anschließenden Sektion der Versuchshunde nicht. Die von Appel et al. angeführten Untersuchungen wurden in den USA durchgeführt, sodaß man auch hier von der Vermutung ausgehen muß, daß es sich primär um B. burgdorferi sensu stricto-Stämme gehandelt hat. Ähnliche Infektionsversuche mit B. afzelii oder B. garinii wurden beim Hund bisher nicht durchgeführt.
Verschiedene Labormethoden und deren Grenzen
Bei allen Labormethoden bezüglich der Borreliose beim Hund muß man beachten, daß die Ergebnisse lediglich Hilfsmittel zur Diagnosestellung sein können und auf keinen Fall eine sorgfältige klinische Untersuchung unter Abklärung der in Frage kommenden Differentialdiagnosen ersetzen können.
Prinzipiell unterscheidet man zwischen :
A) Direkten Verfahren
1.) Anzucht der Borrelien, z.B. aus Synovia
2.) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (im engeren Sinne kein direktes Nachweisverfahren, da lediglich DNA nachgewiesen wird und keine Aussage über die Vitalität des Erregers gemacht werden kann)
B) Indirekten Verfahren des Erregernachweises = Serologie
1.) Indirekter Hämagglutinationstest (IHA)
2.) Immunfluoreszenstest (IFT)
3.) Enzym-Immunoassay (EIA)
4.) Western- bzw. Immunoblot
Direkte Verfahren
Anzucht der Borrelien: Die Anzucht der Borrelien aus den betroffenen Regionen oder Organen gelingt sehr selten und ist zudem noch sehr langwierig. Man benötigt dazu ein Spezial-Nährmedium (BSK-II) und muß dieses bis zu 5 Wochen bebrüten. Burmester et al. (1997) gehen bei der Anzucht aus Blut, oder Synovia von einer Isolationsrate von maximal 10% aus. Ebenso schwierig ist folglich eine direkte Anfärbung des Erregers (z.B. mittels Silberfärbung). In seltenen Fällen kann man evtl. mit Hilfe der Dunkelfeld-Mikroskopie die Borrelien direkt nachweisen, wobei auf die Problematik von Artefakten bzw. verwandten Bakterien hinzuweisen ist).
Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Die in den letzten Jahren immer populärer werdende PCR als sensitive Nachweismethode bei vielen Infektionskrankheiten, kann nur unter Vorbehalt bei der Borreliose eingesetzt werden, da man bisher immer noch recht wenig über den Aufenthalt der Borrelien in den einzelnen Stadien der Erkrankung oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem Zeckenstich weiß. Berichte über den Nachweis von Borrelien mittels PCR aus dem Urin von Hunden sind nur bedingt verwertbar, da eine genaue Aussage zu welchen Zeitpunkt die Borrelien ausgeschieden werden, nicht möglich ist. In der Humanmedizin wird dieser Nachweis als Erfolgskontrolle bei einer Antibiotika-Therapie eingesetzt. Auch Berichte mittels PCR Borrelien in der Haut nachzuweisen sind vorsichtig zu bewerten, da dieser Nachweis hauptsächlich bei experimentell infizierten Hunden geführt wurde und deshalb die Einstichstelle der Zecke klar definiert war. In der Humanmedizin wird die PCR bisher nur als ergänzende Methode bei unklarer Serologie und klar definiertem klinischen Bild (z.B. bei der Neuroborreliose) empfohlen.
Aufgrund der angefürten Problematik beim direkten Erregernachweis dient die Serologie zur Zeit noch als Methode der Wahl, um eine Borreliose zu diagnostizieren.
Indirekte Verfahren = Serologie
Indirekter Hämagglutinationstest (IHA): Der indirekte Hämagglutinationstest (IHA) eignet sich aufgrund der Einfachheit gut zum Screening. Dabei werden mit Borrelienantigen beladene Schaferytrozyten mit Patientenserum inkubiert. Im positiven Fall kommt es zur Bildung eines klassischen Antigen-Antikörperkomplexes und dadurch zur Agglutionation der Antikörper.
Immunfloureszenztest (IFT) und Enzym-Immunoassay (EIA): Der Immunfluoreszenstest (IFT) erfordert zwar eine größere Erfahrung des Untersuchers als z.B. der Enzymimmunoassay (EIA), Untersuchungen haben aber gezeigt, daß bei richtiger Anwendung sowohl bezüglich der Sensitivität als auch der Spezifität keine Unterschiede zum EIA bestehen. Der IFT gilt als besonders geeignet für Screenings, wobei natürlich auch hier wieder wichtig zu wissen ist, wann welche Antikörpertiter (IgM bzw. IgG) nach Zeckenexposition zu erwarten sind. Auch hierzu gibt es in der Literatur wieder unterschiedliche Angaben wobei dies einmal mit der oft unklaren Anamnese bei natürlicher Exposition zusammenhängt, zum anderen aber auch damit, daß man festgestellt hat, daß ein deutlicher Unterschied bezüglich der Qualität und des Zeitpunktes der Antikörperantwort bei experimentell infizierten Hunden (i.v.-Infektion zum einem sowie die Infektion über den Vektor Zecke zum anderen) besteht. Appel et al. (1993) konnten in ihren bereits oben angeführten Studien eine sich langsammer entwickelnde, aber länger andauernde Antikörperbildung erkennen. Alle Hunde, die infizierten Zecken ausgesetzt waren, bildeten 4-6 Wochen nach Zeckenstich nachweisbare Antikörpertiter (IgG) aus, wobei diese innerhalb der nächsten 6-8 Wochen anstiegen und mindestens 1 Jahr auf diesem hohen Niveau bestehen blieben. Wie sich der Titerverlauf bei IgM verhält, ist nicht endgültig geklärt. Zu erwarten ist, da es sich bei IgM um die Immungloboline der frühen Phase einer Infektion handelt, daß ein positiver Titer früher als bei IgG nachzuweisen ist. Burgess 1988 gibt an, daß sich innerhalb der ersten 4 Wochen bereits ein deutlicher IgM-Titer ausbildet. Allerdings gibt es auch Hinweise in der Literatur, daß sich deutliche IgM -Titer nur bei Erstinfektion (und v.a. bei Hautmanifestationen) nicht aber bei Reinfektionen ausbilden.
Kontrovers wird auch die Frage diskutiert, ob man bei serologischen Untersuchungen grundsätzlich mit antigen verwandten Bakterien (z.B. Treponema phagedenis) absorbieren muß, um eventuelle Kreuzreaktionen auszuschließen. Bekannt ist, daß antigen Verwandte Bakterien aus der Ordnung der Spirochaetales (z. B. Leptospira spp. oder Treponema spp.) zu Kreuzreaktionen führen können. Da man vermutet, daß vor allem in der frühen Phase eine Borrelieninfektion oft starke Reaktionen mit den gemeinsamen Antigenen stattfinden, deshalb könnte unter Umständen eine vorherige Absorption diese Reaktion unterdrücken. Sinnvoller scheint daher die Kombination mit einem
Western- bzw. Immunoblot: als Bestätigungstest. Dazu werden die Antigene von B. burgdorferi mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferriert. Diese wird mit dem Patientenserum inkubiert und anschließend wird die Reaktion des Serums, bzw. der Antikörper im Serum, mittels Substratfärbung sichtbar gemacht. Es entstehen dabei im positive Falle unterschiedliche Banden, die nach ihrer Spezifität für B. burgdorferi interpretiert werden müssen. Dies erfordert einige Erfahrung des Untersuchers und ist auch von dem verwendeten Borrelien-Stamm abhängig. Blenk (1993) gibt in der Humanmedizin folgende Indikationen für den Einsatz des Immunoblots an:
Bei eindeutigem klinischen Bild und negativer Serologie (spielt v.a. in der Humanmedizin eine Rolle, da beim EM oft kein hoher Antikörper-Titer (IgG) im Blut diagnostiziert werden kann),
bei unklarem klinischen Bild und grenzwertigem IFT (1:40 bis 1:80), um zwischen unspezifischer Reaktion, anamnestischen Erregerkontakt oder aktiver Borreliose unterscheiden zu können,
bei fehlender klinischer Symptomatik, aber eindeutigem anamnestischen Hinweis (hat bei der Häufigkeit von Zeckenstichen beim Hund in der Veterinärmedizin eher keine Bedeutung),
zur Abklärung, ob noch eine aktive chronische Infektion nach vorangegangener Antibiose vorliegt. (Neuere Untersuchungen beim Hund (Straubinger et al. 1997) geben Anlaß zur Diskussion, ob durch antibiotische Behandlung überhaupt eine Elimination des Erregers erreicht werden kann und ob sich die Borrelien nicht vielleicht in schlecht vaskularisierten Geweben, z.B. Gelenken, oder intrazellulär "verstecken" um so über Jahre oder evlt. lebenslang im Organismus zu persistieren. Sie konnten zwar die Arthritiden erfolgreich therapieren, hatten auch nach 30-tägiger Antibiotikabehandlung auch eine deutliche Reduzierung der Antikörpertiter, teilweise bis unter die Nachweisgrenze, aber 6 Monate nach der Behandlung waren wieder Antikörper gegen B. burgdorferi nachweisbar.)
Übertragen auf die Veterinärmedizin scheint der Einsatz des Immunoblots vor allem bei grenzwertigen bzw. niederen Titern sinnvoll zu sein, um unspezifische Reaktionen ausschließen zu können. Auch bei klarem klinischen Bild (nach Abklärung der in Frage kommenden Differentilaldiagnosen) und negativer Serologie wäre ein Immunoblot sinnvoll.
Zusammenfassung
Die oben gemachten Ausführungen zeigen, daß die Borrelien-Diagnostik ein schwieriges Gebiet ist. Wenn man jetzt den Durchseuchungsgrad der Zecken in Deutschland (Vermutungen gehen von 20% und mehr der Zeckenpopulation aus) und der Häufigkeit mit der Hunde jedes Jahr von Zecken gestochen werden, betrachtet, versteht man, wie schwierig die Diagnostik der Borreliose beim Hund ist. Unbestritten ist, daß es eine durch B. burgdorferi verursachte Erkrankung gibt. Allerdings muß man darauf hinweisen, daß es auch Berichte aus den USA gibt (Levy und Magnarelli 1992), nach denen von ~50% seropositiver Hunde in einem endemischen Gebiet, lediglich 5% klinische Symptome wie Lahmheit, Gelenkschwellung und Apathie zeigten. Hinzu kam, daß innerhalb des Beobachtungszeitraumes (20 Monate) ebensoviele seronegative Hunde vergleichbare Symptome entwickelten.
Jacobsen et al. (1996) konnten feststellen, daß alle Hunde mit einer für die Borreliose typischen Symptomatik bereits einen deutlichen IgG-Titer hatten. Deshalb erscheint folgende Vorgehensweise bei einem Verdacht auf Borreliose beim Hund sinnvoll:
Verdächtiges klinisches Bild (z.B. wechselnde Lahmheit) unter weitgehendem Ausschluß möglicher Differentialdiagnosen und evtl. anamnestischem Hinweis auf massiven Zeckenbefall (vor ca. 2 Monaten)
¯
IgG-Bestimmung im IFT (oder EIA)
¯
bei grenzwertigem IgG-Titer zwischen 1:40 und 1:80, Kontrollle mittels Immunoblot
¯
bei Titern über 1:80 oder grenzwertigem IgG-Titer und deutlich positivem Immunoblot
¯
Antibiotika-Therapie mit entsprechender klinischer Erfolgskontrolle
Trotz dieser Vorgehensweise kann die Serologie nur ein Hilfsmittel zur Diagnose sein. Letztendlich bleibt die Entscheidung einer Therapie beim behandelnden Tierarzt/ärztin, der das klinische Bild und die entsprechende Anamnese kennt. Vorsichtig interpretiert werden müssen auch Symptome wie ZNS-Störungen, Herzblock oder Nierenschädigungen. Es liegen bisher meiner Meinung nach zu wenig Daten bezüglich dieser Krankheitsbilder im Zusammenhang mit einer Borreliose beim Hund vor. Auch die Frage, ob man bei serologisch positivem Befund ohne klinische Symptome eine Antibiose empfehlen kann, muß der/die behandelnde Tierarzt/ärztin nach o.g. Ausführungen selbst entscheiden. Bei der Vielzahl serologisch positiver Hunde ohne klinische Symptomatik und dem deutlichen Hinweis, daß B. burgdorferi evtl. trotz Antibiotika-Therapie persistieren kann (Straubinger et al., 1997) halte ich persönlich eine grundsätzliche Antibiotika-Therapie nicht für sinnvoll.
Die Borreliose, nicht nur beim Hund, wird auch in näherer Zukunft noch genügend Anlaß zur Diskussion geben. Es bleibt zu hoffen, daß kommende Untersuchungen spezifischer auf die Bedeutung von Borrelia burgdorferi sensu lato bei den einzelnen Tierarten, vor allem in Europa, eingehen.
Literatur
Appel, M.J.G.; S. Allan; R.H. Jacobson; T.L. Lauderdale; Y.F. Chang; S.J. Shin; J.W. Thomford, R.J. Todhunter and B.A. Summers (1993)
"Experimental Lyme Disease in Dogs Produces Arthritis and Persistent Infection"
JID, 167: 651-664
Blenk, H. (1993)
"Serodiagnostik der Lyme-Borreliose"
mta, 8(6): 575-580
Burmester, G.-R.; S. Priem und A. Krause (1997)
"Erregerpersistenz von B. burgdorferi: Direktnachweismethoden"
2. Frankfurter-Gießener Borrelien-Workshop , Tagungsbericht S. 3
Grauer, G.F.; E.C. Burgess; A.J. Cooley and J.H. Hagee (1988)
"Renal lessions associated with Borrelia burgdorferi infection in a dog"
JAVMA, 193: 237-239
Jacobson, R.H.; Y.-F. Chang and S.J. Shin (1996)
"Lyme Disease: Laboratory Diagnosis of Infected and Vaccinated Symptomatic Dogs"
Seminars in Veterinary Medicine and Surgery (Small Animal), 11(3): 172-182
Levy, A. and A. Magnarelli (1992)
"Relationship between development of antibodies to Borrelia burgdorferi in dogs and the subsequent development of limb/joint borreliosis"
JAVMA, 200: 344-347
Levy, A. and P.H. Duray (1988)
"Complete Heart Block in a Dog Seropositive for Borrelia burgdorferi"
J. Vet. Intern. Med., 2: 138-144
straubinger, R.K.; B.A. Summers; Y.-F. Chang and M.J.G. Appel (1997)
"Persistence of Borrelia burgdorferi in Experimentally Infected Dogs after Antibiotic Treatment"
J. Clin. Microbiol., 35(1): 111-116
Wasmoen, T.L.; R.W. Sebring; B.M. Blumer; L.G. Chavez; H.-J. Chu and w.M. Acree (1992)
"Examination of Koch`s postulates for Borrelia burgdorferi as the causative agent of limb/joint dysfunction in dogs with borreliosis"
JAVMA, 201(3): 412-418
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